Содержание
Проблема резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам является одной из наиболее актуальных в современной урологии. Хронический бактериальный простатит (ХБП) представляет собой существенную медико-социальную проблему, затрагивающую значительное количество мужчин репродуктивного возраста и негативно влияющую на качество их жизни. По современным представлениям, патогенез данного заболевания тесно связан с формированием биопленок, что значительно усложняет эрадикацию возбудителей и способствует хронизации воспалительного процесса. Трудности в терапии ХБП обусловлены не только особенностями строения предстательной железы и наличием гематопростатического барьера, ограничивающего проникновение антибактериальных препаратов, но и возрастающей резистентностью микроорганизмов к антибиотикам различных групп.
Этиологическая структура возбудителей ХБП претерпела существенные изменения за последние десятилетия. Если ранее основными патогенами считались грамотрицательные бактерии, то в настоящее время всё большее значение приобретают грамположительные кокки. Согласно современным данным, в последние годы отмечается увеличение частоты выделения грамположительной кокковой и неклостридиальной анаэробной флоры при бактериологических исследованиях секрета предстательной железы. Особую роль в этиологии ХБП играют коагулазоотрицательные стафилококки и энтерококки, что подтверждается многочисленными исследованиями. Так, например, в работах ряда авторов показано, что Enterococcus faecalis является одним из значимых возбудителей данного заболевания.
Рациональная антибактериальная терапия ХБП представляет значительные трудности ввиду постоянно растущей резистентности уропатогенов к широко используемым антимикробным препаратам. Важным аспектом эффективного лечения является наличие актуальных данных о чувствительности патогенов к антибиотикам в конкретном регионе, что обусловливает необходимость проведения регулярного мониторинга антибиотикорезистентности.
Целью настоящего исследования стало изучение антибиотикорезистентности штаммов грамположительных кокков, выделенных из секрета предстательной железы мужчин с хроническим бактериальным простатитом, на уровне фено- и генотипа.
Материалы и методы
В исследование были включены 26 пациентов мужского пола в возрасте от 20 до 45 лет с диагнозом «хронический бактериальный простатит», находившихся на амбулаторном лечении в отделении охраны репродуктивного здоровья Оренбургского областного перинатального центра. Диагностический алгоритм включал тщательный сбор анамнеза, оценку субъективных жалоб пациентов, физикальное обследование с обязательным проведением трансректального ультразвукового исследования (ТРУЗИ) и пальцевого ректального исследования предстательной железы. Для объективизации симптоматики применяли опросники — шкалу оценки симптомов хронического простатита Национального института здоровья США (NIH-CPSI) и Международный индекс эректильной функции (IIEF-5).
Критериями постановки диагноза ХБП и включения пациентов в исследование служили:
- Наличие характерных клинических признаков (болевой синдром различной локализации, расстройства мочеиспускания, нарушения эякуляции)
- Лейкоцитоз в секрете предстательной железы (более 10-15 лейкоцитов в поле зрения) или в постмассажной порции мочи
- Бактериологическое подтверждение наличия возбудителя
- Длительность заболевания не менее одного года
- Возраст от 20 до 45 лет
Из исследования были исключены пациенты с инфекциями, передаваемыми половым путем. При обследовании больных соблюдались требования национального стандарта РФ ГОСТ Р 52379-2005 о надлежащей клинической практике.
Материалом для бактериологического исследования служил секрет предстательной железы, полученный после массажа. Забор материала осуществляли в стерильные контейнеры, доставка в лабораторию производилась в течение 15 минут. Выделение микроорганизмов проводили по стандартным бактериологическим методикам с использованием селективных питательных сред: желточно-солевого агара для культивирования стафилококков и Schaedler-агара для выделения энтерококков. Идентификацию выделенных культур выполняли с помощью масс-спектрометрии на приборе MALDI-TOF серии Microflex (Bruker Daltonics, Германия), расчет коэффициента достоверности осуществляли с использованием программного обеспечения Maldi BioTyper 3.0.
Оценку чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом согласно методическим указаниям 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В работе использовали стандартные диски с 16 антибиотиками: меропенем, имипенем, эртапенем, цефотаксим, цефтазидим, цефоперазон, цефтриаксон, цефепим, амоксиклав, оксациллин, амикацин, гентамицин, тобрамицин, левофлоксацин, энрофлоксацин, ломефлоксацин.
Для молекулярно-генетического анализа выделение ДНК осуществляли из бактериальных суспензий (10^7 КОЕ/мл) суточной агаровой культуры сорбционным методом с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» (ИнтерЛабСервис, Россия). Детекцию генов антибиотикорезистентности проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров.
Всего в исследовании было изучено 120 клинических изолятов грамположительных микроорганизмов, в том числе 31 штамм Enterococcus faecalis и 91 культура коагулазоотрицательных стафилококков различных видов: Staphylococcus epidermidis (43 штамма), Staphylococcus warneri (21 штамм), Staphylococcus haemolyticus (18 штаммов), Staphylococcus saprophyticus (9 штаммов). Полученные данные были обработаны с использованием статистических методов.
Результаты исследования
Проведенное фенотипическое исследование антибиотикорезистентности выделенных штаммов позволило установить ряд закономерностей. Культуры Enterococcus faecalis продемонстрировали высокий уровень устойчивости к большинству протестированных антибактериальных препаратов. В 96,8% случаев энтерококки были резистентны к фторхинолонам (левофлоксацин, энрофлоксацин, ломефлоксацин), оксациллину, цефтазидиму, цефтриаксону и цефепиму. Высокая частота резистентности отмечалась также к гентамицину, карбапенемам (меропенем, имипенем, эртапенем) и цефотаксиму — по 67,6% устойчивых изолятов.
Среди коагулазоотрицательных стафилококков (CoNS) различных видов наблюдались существенные различия в профилях антибиотикорезистентности. Наиболее высокий уровень устойчивости к фторхинолонам продемонстрировали изоляты Staphylococcus saprophyticus, у которых регистрировалась 100% резистентность к левофлоксацину и энрофлоксацину. Все штаммы данного вида также характеризовались полной устойчивостью к гентамицину, цефотаксиму и эртапенему; в 88,9% случаев — к цефтазидиму и цефепиму; в 89% случаев — к тобрамицину и амикацину.
Штаммы Staphylococcus epidermidis в 50% случаев проявляли устойчивость к карбапенемам (меропенем, имипенем, эртапенем), амикацину, оксациллину и цефотаксиму. К гентамицину и цефепиму были резистентны 74,4% изолятов, а к цефтазидиму и фторхинолонам — подавляющее большинство выделенных культур (по 95,4%).
При исследовании штаммов Staphylococcus warneri установлена их полная резистентность к гентамицину, 42,9-47,6% изолятов были устойчивы к карбапенемам, 52,5% — к оксациллину и ломефлоксацину, 47,6-57,1% — к различным цефалоспоринам, за исключением цефоперазона.
Все культуры Staphylococcus haemolyticus продемонстрировали резистентность к оксациллину, цефотаксиму и цефтазидиму; около половины изолятов характеризовались устойчивостью к фторхинолонам, карбапенемам и цефепиму.
Важно отметить, что 33% протестированных изолятов коагулазоотрицательных стафилококков и 40% штаммов Enterococcus faecalis характеризовались множественной лекарственной устойчивостью, проявляя резистентность к антимикробным препаратам, относящимся к трем различным группам. Более того, 20% культур E. faecalis были устойчивы к антибиотикам из четырех групп, что свидетельствует о формировании выраженной полирезистентности.
Наиболее эффективными в отношении изученных микроорганизмов оказались амоксиклав и цефоперазон: все изоляты стафилококков и 35,5% штаммов энтерококков сохраняли к ним чувствительность.
Молекулярно-генетическое исследование позволило выявить распространенность генов антибиотикорезистентности среди изученных штаммов. Ген mecA, обусловливающий устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, наиболее часто (в 50% случаев) обнаруживался у культур S. epidermidis и S. haemolyticus, реже — у E. faecalis (32%). Ген резистентности к ампициллину blaZ регистрировался у всех изолятов S. epidermidis и S. warneri, у 50% штаммов S. haemolyticus и 32% культур E. faecalis.
Исследование генетических детерминант устойчивости к аминогликозидам показало, что ген aac(6′)-aph(2»), кодирующий бифункциональный фермент модификации аминогликозидов, присутствовал у 100% штаммов S. haemolyticus и 80,6% культур E. faecalis. Ген ant(4′)-Ia был обнаружен у половины изученных стафилококков двух видов (S. epidermidis и S. haemolyticus). Высокая частота выявления гена aph(3′)-IIIa отмечена у 80,6% штаммов E. faecalis и 89% изолятов S. saprophyticus.
Интересно, что гены резистентности к фторхинолонам (gyrA и grlA) не были выявлены у изолятов коагулазоотрицательных стафилококков, в то время как ген grlA обнаруживался у 48,3% культур E. faecalis.
Обсуждение
Полученные в настоящем исследовании результаты демонстрируют высокий уровень резистентности грамположительных кокков, выделенных у пациентов с хроническим бактериальным простатитом, к различным группам антибактериальных препаратов. Особую обеспокоенность вызывает устойчивость к фторхинолонам, которые традиционно считаются препаратами выбора для терапии данного заболевания. Наблюдаемая высокая частота резистентности энтерококков к фторхинолонам согласуется с данными других исследователей, отмечающих рост устойчивости уропатогенов к данной группе антибиотиков.
При анализе генетических детерминант антибиотикорезистентности установлено, что один из наиболее клинически значимых генов энтерококков — aac(6′)-aph(2»), кодирующий бифункциональный фермент модификации аминогликозидов и обусловливающий устойчивость к гентамицину, присутствовал у 80,6% штаммов E. faecalis. Проведенный корреляционный анализ выявил достоверную высокую положительную связь между наличием данного гена и фенотипическим проявлением устойчивости к гентамицину у энтерококков (r=0,94, p<0,05), что свидетельствует о важной роли этого механизма в формировании резистентности.
Интересно отметить, что среди изученных стафилококков наблюдалась картина фенотипической устойчивости к гентамицину при отсутствии соответствующих генов резистентности. Исключение составили культуры S. haemolyticus, у которых выявлялся ген aac(6′)-aph(2»), но фенотипически они сохраняли чувствительность к данному препарату. Аналогичное несоответствие отмечено и в отношении гена ant(4′)-Ia у изолятов S. epidermidis и S. haemolyticus. Подобные расхождения между генетическими и фенотипическими паттернами устойчивости к аминогликозидам у стафилококков описаны и другими авторами.
Важным аспектом проблемы антибиотикорезистентности является распространение метициллин-резистентных (оксациллин-резистентных) стафилококков. Судя по полученным данным, большинство изученных изолятов коагулазоотрицательных стафилококков проявляли устойчивость к оксациллину, что соответствует результатам других исследователей, отмечающих резистентность более чем у 50% клинических штаммов CoNS. Такая устойчивость связана с наличием гена mecA, кодирующего пенициллинсвязывающий белок 2a с низкой аффинностью к бета-лактамам. Присутствие данного гена указывает на потенциальную неэффективность всех бета-лактамных антибиотиков, включая пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы.
Заслуживает внимания тот факт, что энтерококки демонстрируют относительную устойчивость к бета-лактамам и карбапенемам за счет модификации мишени действия антибиотиков вследствие сниженного родства к пенициллинсвязывающим белкам. В исследовании генетические детерминанты устойчивости к бета-лактамным антибиотикам (mecA) были выявлены у 32% культур энтерококков.
Наряду с геном mecA значительную роль в формировании устойчивости бактерий к пенициллинам играет ген blaZ, кодирующий бета-лактамазу. Хотя в литературе отмечается, что случаи выявления энтерококков, продуцирующих бета-лактамазу, остаются редкими, в настоящем исследовании данный ген был обнаружен у 33% изолятов E. faecalis и 50-100% культур коагулазоотрицательных стафилококков различных видов. Это может объясняться возможностью горизонтального переноса гена blaZ между стафилококками и энтерококками.
Отдельного внимания заслуживает вопрос о механизмах формирования устойчивости грамположительных кокков к фторхинолонам. Несмотря на высокий уровень фенотипической резистентности изученных изолятов к данной группе препаратов, гены устойчивости gyrA и grlA не были выявлены у стафилококков. Это может свидетельствовать о наличии других механизмов формирования резистентности, например, связанных с активным выведением антибиотика из клетки или альтернативными мутациями в генах, кодирующих ДНК-гиразу и топоизомеразу IV.
Полученные результаты свидетельствуют о значительной распространенности множественной лекарственной устойчивости среди грамположительных кокков, выделенных у пациентов с хроническим бактериальным простатитом. Это создает серьезные трудности при выборе эффективной антибактериальной терапии данного заболевания и обусловливает необходимость проведения бактериологического исследования с определением чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам в каждом конкретном случае.
Проблема антибиотикорезистентности грамположительных кокков имеет не только клиническое, но и эпидемиологическое значение, поскольку устойчивые штаммы могут циркулировать в стационарах и амбулаторно-поликлинических учреждениях, создавая угрозу возникновения трудно поддающихся лечению инфекций. В этой связи особую актуальность приобретает необходимость проведения регионального мониторинга антибиотикорезистентности микроорганизмов, что позволит оптимизировать подходы к эмпирической антибактериальной терапии.
От автора
Проведенное исследование убедительно демонстрирует масштаб проблемы антибиотикорезистентности грамположительных кокков при хроническом бактериальном простатите. Отсутствие единого антибактериального препарата, эффективного в отношении всех изученных микроорганизмов, заставляет задуматься о новых терапевтических стратегиях.
Мы находимся на пороге того, что некоторые исследователи уже называют «постантибиотиковой эрой» — времени, когда традиционные антимикробные препараты могут утратить свою эффективность из-за широкого распространения резистентных штаммов. В этих условиях необходим комплексный подход к проблеме ХБП, включающий не только рациональную антибиотикотерапию, но и воздействие на другие звенья патогенеза заболевания.
Перспективными направлениями представляются разработка новых классов антибактериальных препаратов с механизмами действия, отличными от традиционных, применение комбинированной терапии, использование адъювантов, способных повышать эффективность существующих антибиотиков, а также методов, направленных на разрушение бактериальных биопленок, играющих важную роль в персистенции возбудителей при хроническом простатите.
Кроме того, необходимо уделять больше внимания профилактическим мероприятиям, включая раннюю диагностику и своевременное лечение острого простатита, что может предотвратить хронизацию воспалительного процесса. Не менее важным является обеспечение комплаентности пациентов — строгое соблюдение ими рекомендаций врача по приему антибактериальных препаратов, что снижает риск формирования резистентных штаммов.
Современная стратегия преодоления антибиотикорезистентности должна основываться на принципах «антимикробного стюардшипа» — рационального использования антибиотиков, основанного на результатах микробиологических исследований и локальных данных о распространенности резистентности. Только такой подход позволит сохранить эффективность имеющихся в нашем распоряжении антибактериальных препаратов и обеспечить возможность успешного лечения инфекционных заболеваний в будущем.
