В современной урологической практике вопросы диагностики и дифференциации хронических форм простатита остаются дискуссионными, несмотря на многолетнюю историю изучения данной проблемы. Хронический бактериальный простатит (ХБП) и хронический простатит/синдром хронической тазовой боли (ХП/СХТБ) типа IIIa представляют собой состояния со схожей клинической картиной, но с принципиально различными диагностическими критериями, определяющими терапевтическую стратегию. Парадоксальность ситуации заключается в том, что классификационная система NIH-NIDDK (1995) проводит демаркационную линию между этими нозологиями исключительно на основе результатов культурального исследования секрета предстательной железы, выполненного на стандартных питательных средах. Простатическая симптоматика, характеризующаяся тазовой болью, дискомфортом в надлонной области, нарушениями мочеиспускания и сексуальной функции, при отсутствии выявляемых стандартными методиками микроорганизмов, но при наличии лейкоцитоза в секрете простаты, трактуется как ХП/СХТБ IIIa, что исключает применение антибактериальной терапии – основного метода лечения ХБП.
Накопленный за последние десятилетия научный материал и клинический опыт заставляют усомниться в валидности существующей дифференциации. Применение современных молекулярно-генетических методик идентификации микроорганизмов в биологическом материале, развитие культуральных технологий и усовершенствование питательных сред создают предпосылки для пересмотра устоявшихся догм относительно «абактериальной» природы ХП/СХТБ IIIa. Многочисленные исследования демонстрируют, что использование расширенного спектра диагностических методик позволяет обнаруживать бактериальные агенты у значительной части пациентов с диагнозом ХП/СХТБ IIIa, что ставит под сомнение саму концепцию «абактериального» характера данного состояния.
В данной статье представлены результаты сравнительного микробиологического исследования секрета простаты у пациентов с ХБП и ХП/СХТБ IIIa с использованием расширенного набора питательных сред и специальных условий культивирования, направленного на переоценку диагностических критериев и терапевтических подходов к обозначенным патологическим состояниям.
Хронический простатит относится к наиболее распространенным урологическим заболеваниям, встречающимся у 8-35% мужчин разных возрастных групп. Клиническая симптоматика хронического простатита характеризуется тазовой болью, дискомфортом в надлонной области, частым и/или затрудненным болезненным мочеиспусканием, чувством неполного опорожнения мочевого пузыря, болезненностью простаты, ухудшением общего самочувствия, сексуальными расстройствами и раздражительностью, имеющими качественные различия проявлений в каждой конкретной категории заболевания.
Согласно классификационной системе NIH-NIDDK (1995), основным лабораторным критерием дифференцировки ХБП от ХП/СХТБ IIIa является «инфекционный статус» секрета простаты при повышенном содержании лейкоцитов: идентификация возбудителей в случае ХБП и их «отсутствие» при ХП/СХТБ. Данный подход десятилетиями определяет терапевтические стратегии, однако следует отметить, что таким критерием отбора пациентов для антибактериальной терапии является верификация микроорганизмов именно на стандартных питательных средах при типичных условиях культивирования.
В последние годы опубликовано немало работ, в которых делается акцент на том, что ХП/СХТБ IIIa, возможно, представляет собой неверифицированный или недодиагностированный ХБП. Это предположение основывается на результатах исследований с применением современных высокочувствительных диагностических методик, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммунотесты, технологии клеточных культур McCoy cells и секвенирование 16s рРНК/ДНК. Использование данных технологий для исследования биологического материала мужчин с диагнозом ХП/СХТБ IIIa позволяет идентифицировать различные таксоны микроорганизмов, которые при стандартном бактериологическом исследовании не определяются.
Разработанная и валидированная D. A. Shoskes с соавторами (2009) классификационная система фенотипирования ХП/СХТБ, основанная на формировании ряда доменов – UPOINTS, косвенно подтверждает гипотезу о недодиагностике ХБП. В данной системе выделен домен I – infection, предполагающий идентификацию в секрете простаты грамотрицательных микроорганизмов (предположительно семейства Enterobacteriaceae) и/или представителей семейства Enterococcaceae, которые, в свою очередь, являются верифицированными возбудителями ХБП. Однако в данном домене не отражена возможная этиологическая роль коагулазонегативных стафилококков (КОС), неклостридиальных анаэробных бактерий (НАБ), интрацеллюлярных микроорганизмов и других потенциальных патогенов, которые могут выступать в качестве этиологических агентов ХБП или ХП/СХТБ IIIa. Тем не менее, разработчики данной классификационной системы указывают на потенциально бактериальный генез воспалительного процесса в простате при ХП/СХТБ IIIa.
Существующая дихотомия в классификации и, соответственно, в тактике лечения ХБП и ХП/СХТБ IIIa, основанная исключительно на результатах стандартного бактериологического исследования, вызывает обоснованные сомнения с позиций современных представлений о микробиологии урогенитального тракта и требует пересмотра с целью оптимизации лечебно-диагностических алгоритмов.
Принимая во внимание вышеизложенное, была сформулирована исследовательская проблема: каковы сходства и различия в микробиологическом спектре секрета простаты у пациентов с ХБП и ХП/СХТБ IIIa при его экстенсивном анализе на расширенном наборе питательных сред? Проведенный поиск публикаций в базах данных PubMed/Medline, Web of Science, SCOPUS, ScienceDirect, eLIBRARY c использованием ключевых слов prostatic secretion assay, Meares-Stamey, 2 glass test, CP/CPPS, bacterial prostatitis, CBP, PCR показал немногочисленность валидных работ, содержащих информацию по данной проблеме.
Целью исследования стало проведение сравнительного анализа микробиоты секрета предстательной железы у пациентов при ХБП и ХП/СХТБ IIIa с использованием расширенного набора питательных сред и особых условий культивирования.
Было проведено полномасштабное проспективное сравнительное неконтролируемое исследование с 2010 по 2018 г. В него был включен 101 мужчина в возрасте от 20 до 60 лет с простатитоподобными симптомами, беспокоящими их более 3 месяцев, которые обратились амбулаторно в урологическое отделение Клиники РостГМУ. Биологический материал от пациентов получали путем проведения пробы Meares–Stamey, при этом секрет простаты собирали в стерильные емкости с транспортной средой AMIES Protagerm (BioMerieux, Marcy l’Etoile, Франция) и доставляли в лабораторию в течение 15 минут. Последующее хранение образцов биоматериала осуществляли в соответствии c основными положениями и требованиями преаналитического этапа лабораторных исследований.
Перед посевом на питательные среды производили 10-кратные разведения секрета простаты в среде Blaurock от 10^-1 до 10^-10 КОЕ/мл с последующей аппликацией на плотные питательные среды 0,1 мл бактериальной взвеси. По результатам микроскопии секрета простаты у всех пациентов были определены воспалительные изменения.
На первом этапе исследования выполнялось бактериологическое исследование секрета простаты на стандартной питательной среде (MacConkey Agar) в типичных условиях культивирования. По результатам исследования секрета простаты были сформированы две группы пациентов согласно основному группообразующему критерию — идентификации в секрете простаты таксонов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae: E. coli, Proteus spp., Klebiella spp. В первую группу вошли 49 мужчин, у которых в секрете простаты были определены вышеуказанные таксоны бактерий, во вторую – 52 пациента, не имевших энтеробактерий в биоматериале и/или с первично негативными результатами исследования секрета простаты.
Второй этап заключался в бактериологическом исследовании образцов секрета простаты у всех (n=101) пациентов на расширенном наборе питательных сред в специальных условиях культивирования. В качестве селективных сред были использованы плотные питательные среды для факультативно-анаэробных бактерий (ФАБ) – среда MacConkey, HiChrome Selective Agar для Enterococci spp., HiChrome Selective Agar для грибов, HiChrome Selective Agar для Klebsiellae spp., HiChrome Selective Agar для Staphylococci spp.; для неклостридиальных анаэробных бактерий (НАБ) – Bile Esculin Agar, Shadler Agar, Blaurock Broth, Shadler Broth. Посевы инкубировали в аэробных (24–48 ч) и анаэробных (48–72 ч) условиях со специальным газовым составом (10% СО2, 10% Н2, 80% N2) в анаэростате АЭ-01 («НИКИ МЛТ-Поволжье», Россия) при 37°С. Биохимическую идентификацию бактерий осуществляли с помощью тест-систем EN-COCCUS test, STAPHYtestI6, NEFERMtest24, ENTEROScreen и т.д. («PLIVA-Lachema», Чехия).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием прикладного пакета Statistica 10.2 («StatSoft Inc.», США). Описательная статистика количественных признаков (титра, частоты встречаемости) представлена в виде центральной тенденции медианы (Me) и интерквартильного размаха (25-й и 75-й процентили – LQ; UQ), а также среднего (M) и стандартного отклонения среднего (m). В тексте данные представлены как Ме [LQ; UQ] и M±m. Нормальность распределения показателей определяли с помощью теста Шапиро–Вилка, сравнение независимых переменных в группах проводили с помощью непараметрических статистических методов – U-тест Манна–Уитни (принятые уровни достоверности p<0,05 и p<0,01).
Для повышения качества микробиологического анализа мы модифицировали стандартный протокол культивирования бактерий, адаптировав его к особенностям простатического секрета. Использование специальных сред для культивирования анаэробных бактерий и оптимизированных условий инкубации повысило вероятность выделения широкого спектра микроорганизмов, включая требовательные штаммы, часто не определяемые при рутинных исследованиях.
Согласно полученным результатам бактериологического исследования с применением расширенного набора питательных сред, в секрете простаты пациентов обеих групп было идентифицировано 28 таксонов микроорганизмов (25 – в первой группе и 24 – во второй). При этом в 95% наблюдений в обеих группах были идентифицированы поликомпонентные микробные ассоциации, состоящие из 2 и более микроорганизмов. Данный факт указывает на сложность микробиоценоза предстательной железы и необходимость его всестороннего изучения для понимания патогенеза воспалительных процессов в этом органе.
Анализ встречаемости микроорганизмов в секрете простаты показал, что в первой группе чаще идентифицировали Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Peptococcus spр., Eubacterium spp., S. epidermidis, во второй – Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Peptococcus spр., Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp., S. haemolyticus, S. warneri. В целом частота выявления в секрете простаты Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Peptococcus spр. и Peptostreptococcus spp. в обеих группах оказалась сопоставимой. Для определения значимости различий встречаемости микроорганизмов показатели обеих групп были протестированы с применением непараметрического U-теста Манна–Уитни.
Заслуживает внимания тот факт, что в группе ХП/СХТБ IIIa (вторая группа) статистически значимо чаще, чем в группе ХБП (первая группа), определяли некоторые представители кластера неклостридиальных анаэробных бактерий: Peptococcus spр., Propionibacterium spp., Bacteroides spp., Veillonella spp.; коагулазонегативных стафилококков: S. haemolyticus, S. warneri, а также грамположительные таксоны микроорганизмов: Corynebacterium spp. и Str. agalacticae. Примечательно, что в группе ХБП достоверно чаще выявляли только микроорганизмы, выступавшие в качестве рандомизирующего фактора: E. coli, Klebsiella spp. и Proteus spp. По частотам встречаемости других микроорганизмов достоверных различий выявлено не было.
Детальный анализ обсемененности секрета простаты различными таксонами микроорганизмов продемонстрировал интересные закономерности. В группе ХБП наибольший титр (КОЕ/мл) был отмечен для E. coli (10^1–10^8), Proteus spp. (10^2–10^6), Klebsiella spp. (10^1–10^5), а также для некоторых таксонов неклостридиальных анаэробных бактерий: Peptococcus spp. (10^1–10^4), Peptostreptococcus spp. (10^1–10^4), Propionibacterium spp. (10^1–10^5), коагулазонегативных стафилококков – S. haemolyticus, S. lentus (10^1–10^5), Еnterococcus spp. (10^1–10^5) и S. aureus (10^1–10^5). В группе ХП/СХТБ IIIa максимальные показатели титра в большинстве случаев были ограничены уровнем 10^3 КОЕ/мл. Только у трех таксонов микроорганизмов титр обсемененности составил 10^4 КОЕ/мл: S. warneri, Enterococcus spp., Corynebacterium spp.
В абсолютных значениях в группе ХБП в большинстве случаев чаще верифицировали микроорганизмы в титре 10^2 КОЕ/мл, в группе ХП/СХТБ IIIa – в титре 10^1 КОЕ/мл. Таким образом, в группе ХБП по сравнению с группой ХП/СХТБ IIIa для ряда микроорганизмов была характерна более высокая концентрация с более выраженным разбросом значений.
Статистически значимые различия в титре микроорганизмов между группами были установлены только для Peptococcus spр. и Enterococcus spp. После сопоставления этих результатов со значениями частоты их идентификации в секрете простаты было определено, что показатели выявляемости Peptococcus spр. в группе ХП/СХТБ IIIa были выше, чем в группе ХБП (p<0,05), при этом средние титровые показатели данных бактерий, напротив, были более значительными в группе ХБП (p<0,05).
Анализ компонентного состава микробных ассоциаций выявил преобладание в группе ХБП 4- и 5-компонентных бактериальных сообществ, тогда как в группе ХП/СХТБ IIIa чаще определялись 6-, 7- и 8-таксонные микробные композиции. Данное наблюдение может иметь существенное значение при разработке терапевтических стратегий, требуя более тщательного подбора антибактериальных препаратов для эффективного воздействия на весь спектр возможных патогенов.
Этиопатогенез ХБП и ХП/СХТБ представляет собой сложную комбинацию последовательно и параллельно протекающих процессов иммунного, сосудистого, нейроэндокринного и иного характера. При этом бактериальная инвазия может выступать в качестве триггерного фактора, инициирующего развитие патологических процессов в предстательной железе через каскад множества клеточных и гуморальных реакций.
В аннотации к системе фенотипирования UPOINT (2009) подчеркивается, что она первично разработана для определения терапевтической стратегии при ХП/СХТБ на основе идентификации определенных признаков, в том числе инфекционного фактора (домен I – infection). Авторы в данном разделе классификации валидировали идентификацию в секрете простаты только грамотрицательной (энтеробактериальной) и энтерококковой флоры – облигатных возбудителей ХБП. Однако использование расширенного набора питательных сред и особых условий культивирования позволило идентифицировать в секрете простаты пациентов обеих групп широкий спектр поликомпонентных ассоциаций микроорганизмов, практически идентичных по своему таксономическому составу.
В группе ХП/СХТБ IIIа в отсутствие энтеробактерий отмечено значительное увеличение удельного веса грамположительной флоры (Corynebacterium spp. и Enterococcus spp.), а также представителей неклостридиальных анаэробных бактерий (Peptococcus spр., Propionibacterium spp., Bacteroides spp., Veilonella spp.) и коагулазонегативных стафилококков (S. haemolyticus, S. warneri). Кроме этого, в группе ХП/СХТБ IIIa были верифицированы, хотя и в довольно небольшом количестве, сапрофитные микроорганизмы, отсутствовавшие в секрете простаты пациентов с ХБП – Str. agalacticae и Мicrococcus spp., которые при снижении иммунного статуса могут вызывать тяжелые инфекционно-воспалительные изменения, а также представитель кишечной/влагалищной нормофлоры Lactobacterium spp.
Отдельного внимания заслуживает приблизительно двукратное увеличение встречаемости (однако статистически недостоверное) в группе ХП/СХТБ IIIa S. aureus – нормального комменсала кожи, обладающего широким набором мембранотоксинов, эксфолиатинов и других факторов вирулентности, способных индуцировать развитие при определенных условиях тяжелого деструктивного воспалительного процесса в органах и тканях.
На основании полученных данных можно предположить, что более разнообразный таксономический состав секрета простаты в группе ХП/СХТБ IIIа связан с отсутствием представителей семейства Enterobacteriaceae, в частности E. coli и K. pneumoniae, которые продуцируют достаточно мощные бактериоцины (колицины Е1, Е6, Е7, К и М и микоцины – E. coli, клебоцины – К. pneumoniae), подавляющие рост иной микрофлоры. Известно, что бактериоцины являются рибосомально синтезируемыми антимикробными пептидами, продуцируемыми многими бактериями и обладающими бактерицидным действием в отношении близкородственных штаммов. Они могут влиять на состав микробиоценоза, создавая конкурентные преимущества для продуцирующих их микроорганизмов.
С другой стороны, данные анализа концентраций бактерий показывают, что в группе ХП/СХТБ IIIa по сравнению с группой ХБП средний титр микроорганизмов ниже и характеризуется меньшей количественной вариацией. Это может свидетельствовать о различных патогенетических механизмах формирования воспалительного процесса в предстательной железе: в случае ХБП – прямое повреждающее действие высоких концентраций патогенных бактерий, в случае ХП/СХТБ IIIa – иммунопатологические реакции на присутствие условно-патогенных микроорганизмов в низких титрах.
Согласно клиническим рекомендациям Европейской Ассоциации Урологов (EAU), таксоны микроорганизмов, идентифицированных в секрете простаты пациентов обеих групп, относятся к кластеру «обсуждаемых» штаммов. B. Lobel с соавторами в своем обзоре приводят альтернативную классификационную систему, разделяющую бактерии на пять классов по их потенциальной роли в формировании воспалительного процесса в предстательной железе. Согласно данной классификации, спектр выделенных из секрета простаты микроорганизмов может быть разделен на три категории: 2-я категория – вероятные патогены: грамположительные микроорганизмы – Enteroccoccus spp. и S. aureus; 3-я категория – возможные патогены: коагулазонегативные стафилококки, неклостридиальные анаэробные бактерии, грибы рода Candida; 4-я категория – признанные непатогенными для простаты таксоны микроорганизмов: Lactobacillus, Сorynebacterium spp.
В работе J. Xiao с соавторами посредством использования ПЦР и 16s рДНК ПЦР генного клонирования и секвенирования удалось выделить из секрета простаты 111 мужчин с симптоматикой ХП/СХТБ (IIIa и IIIb) широкий спектр микроорганизмов, относящихся ко 2–4-й категориям по классификации B. Lobel: U. urealyticum, C. trachomatis, HSV-2, HPV CMV, а также Staphylococcus, Pseudomonas, Achromobacter, Enterobacter, Prevotella и др. При этом исследователями с помощью точного теста Фишера была определена достоверная прямая корреляция между уровнем повышения лейкоцитов и лектина в секрете простаты и количеством детектированных микроорганизмов.
Несмотря на разнообразие идентифицированного микробного спектра, остается открытым вопрос о том, какие именно таксоны микроорганизмов способны вызывать простатит. Стоит подчеркнуть, что при экспериментальном моделировании простатита на кроликах New Zealand с использованием низких титров патогенов было констатировано развитие воспалительного процесса в простате при инфицировании S. haemolyticus и E. coli (в качестве контроля) и несколько менее выраженного воспаления при инокуляции Peptococcus niger. Результаты данного эксперимента демонстрируют вероятностную облигатную причастность некоторых таксонов микроорганизмов, таких как Peptococcus niger, к развитию простатита. Эти бактерии могут: 1) индуцировать и поддерживать развитие воспалительного процесса, но при стандартном обследовании не определяться на обычном наборе питательных сред; 2) выступать триггером активации инфламмасом и инициации воспалительных изменений, которые будут протекать по «порочным кругам» даже после элиминации бактерий посредством иммунной клеточной реакции.
Современные исследования показывают, что активация инфламмасом – мультипротеиновых комплексов, участвующих в инициации воспалительного ответа, может происходить не только под действием патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs), но и эндогенных сигналов опасности (DAMPs), высвобождающихся при тканевом повреждении. Это объясняет возможность персистенции воспалительной реакции даже после элиминации инфекционного агента и обосновывает необходимость комплексного подхода к терапии хронического простатита, включающего не только антибактериальные, но и противовоспалительные препараты.
Результаты исследования согласуются с данными других авторов, указывающих на потенциальную роль некультивируемых или трудно культивируемых микроорганизмов в патогенезе ХП/СХТБ IIIa. Так, N. Krieger с соавторами при использовании культуральных методов и ПЦР установили, что более чем у 8% пациентов с хроническим простатитом без бактериурии могут быть обнаружены C. trachomatis, U. urealyticum и M. hominis. A.J. Schaeffer с соавторами в своей работе также акцентировали внимание на вероятной роли некультивируемых микроорганизмов, включая хламидии, микоплазмы и трихомонады, в патогенезе ХП/СХТБ. Эти данные, а также результаты подтверждают необходимость пересмотра диагностических подходов и классификационных систем в отношении хронического простатита.
Проведенное исследование демонстрирует, что отсутствие в секрете простаты энтеробактерий или отрицательных результатов обнаружения микроорганизмов при стандартном бактериологическом исследовании при наличии простатитоподобных симптомов и повышения количества лейкоцитов в секрете простаты не означает неинфекционной природы ХП/СХТБ IIIa.
Расширенное бактериологическое исследование простатического секрета позволяет идентифицировать разнообразные поликомпонентные микробные ассоциации, сходные по спектральному составу с таковыми при ХБП, но с характерным увеличением частоты встречаемости представителей неклостридиальных анаэробных бактерий, коагулазонегативных стафилококков и грамположительной флоры. Полученные данные заставляют задуматься о пересмотре существующей классификации NIH-NIDDK (1995) и подходов к диагностике и терапии ХП/СХТБ IIIa.
Современная урологическая практика стоит на пороге парадигмального сдвига в понимании природы хронического простатита. Представление о предстательной железе как о стерильном органе уходит в прошлое, уступая место концепции простатического микробиома – сложной экосистемы, включающей разнообразные таксоны микроорганизмов, находящиеся в динамическом равновесии. Нарушение этого равновесия может приводить к развитию воспалительных процессов с различной клинической симптоматикой, а определение роли отдельных таксонов микроорганизмов в поддержании гомеостаза или индукции патологических изменений становится ключевой задачей для разработки персонализированных терапевтических стратегий.
Результаты исследования позволяют предположить, что ХБП и ХП/СХТБ IIIa представляют собой не принципиально различные нозологические формы, а скорее варианты единого патологического состояния с различными микробиологическими характеристиками. Применение расширенного спектра диагностических методик для выявления потенциальных патогенов в секрете простаты и последующая антибактериальная терапия с учетом индивидуального микробиологического профиля могут существенно повысить эффективность лечения пациентов с ХП/СХТБ IIIa.
Современные молекулярно-генетические методы, такие как метагеномное секвенирование, открывают новые перспективы для изучения простатического микробиома и его роли в патогенезе воспалительных заболеваний предстательной железы. Это создает предпосылки для разработки принципиально новых классификационных систем, основанных не только на наличии или отсутствии определенных таксонов микроорганизмов, но и на особенностях их взаимодействия с иммунной системой хозяина, генетическом профиле пациента и других факторах, определяющих индивидуальную предрасположенность к развитию хронического простатита.
Интегративный подход к диагностике и лечению хронического простатита, учитывающий сложность микробиологических взаимодействий и индивидуальные особенности пациента, может стать ключом к повышению эффективности терапии этого распространенного и социально значимого заболевания.
