Содержание
Репродуктивное здоровье мужчин представляет собой комплексную проблему современной медицины, затрагивающую не только физиологические аспекты, но и социально-демографические вопросы. Статистические данные последних десятилетий демонстрируют неуклонный рост частоты андрологических заболеваний, в особенности у мужчин репродуктивного возраста, что не может не вызывать обеспокоенности специалистов. Среди множества факторов, влияющих на фертильность мужчин, особое внимание привлекают механизмы повреждения генетического материала сперматозоидов, которые могут реализовываться независимо от традиционных параметров спермограммы. Даже при нормозооспермии нарушения целостности ДНК в сперматозоидах могут оказывать критическое влияние на способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбриона.
Современное понимание механизмов фрагментации ДНК сперматозоидов связывает это явление с несколькими ключевыми процессами: нарушениями ремоделирования хроматина в ходе сперматогенеза, апоптотическими событиями в половых клетках и оксидативным стрессом, вызванным избыточной продукцией активных форм кислорода. В контексте урологических заболеваний, таких как варикоцеле и простатит, представляется особенно важным выяснить, насколько эти состояния могут способствовать повреждению генетического материала сперматозоидов и через какие патофизиологические механизмы это реализуется.
Исследования последних лет свидетельствуют о том, что целостность ДНК сперматозоидов играет ключевую роль не только в естественном зачатии, но и при применении вспомогательных репродуктивных технологий. Вместе с тем, до сих пор сохраняется дискуссия о референтных значениях индекса фрагментации ДНК (ИФД) сперматозоидов и о стандартизации методов его определения. В этой связи представляется актуальным проведение исследований, направленных на установление связей между андрологическими заболеваниями и нарушениями целостности ДНК сперматозоидов, что может иметь важное значение для диагностики и прогноза мужской фертильности.
Целостность ДНК сперматозоидов представляет собой один из важнейших факторов, определяющих мужскую фертильность и здоровье будущего потомства. Многочисленные исследования подтверждают критическую роль неповрежденного генетического материала в успешной передаче наследственной информации. Нарушения в генетическом материале сперматозоидов встречаются у мужчин довольно часто и могут проявляться различными способами: хромосомными мутациями (делециями и анеуплоидией), эпигенетическими модификациями ДНК или гистонов, генными или точечными мутациями, окислением нуклеотидных оснований и, наконец, непосредственной фрагментацией ДНК. Данный спектр генетических нарушений существенно влияет на репродуктивный потенциал мужчины, независимо от стандартных параметров спермограммы.
В процессе дифференцировки мужских гамет происходит уникальное событие: переход от нуклеосомной организации хроматина к протаминовой укладке. Этот процесс сопровождается возникновением временных разрывов ДНК, которые в норме должны репарироваться. Однако часть этих разрывов может оставаться нерепарированной в зрелых сперматозоидах, что приводит к нарушению целостности ДНК. Кроме того, фрагментация ДНК в дифференцирующихся половых клетках семенников может являться частью апоптотического процесса. Таким образом, фрагментированная ДНК в эякуляторных сперматозоидах может быть результатом незавершенного процесса апоптоза.
Оксидативный стресс представляет собой еще один значимый механизм, приводящий к нарушению целостности ДНК в сперматозоидах. Многие исследователи рассматривают его как основной фактор, способствующий появлению в эякуляте сперматозоидов с фрагментированной ДНК. При определенных патологических состояниях, особенно связанных с воспалением урогенитального тракта, в эякулят попадает значительное количество незрелых половых клеток и лейкоцитов, которые служат основным источником свободных радикалов. Это, в свою очередь, усиливает процесс фрагментации ДНК в зрелых сперматозоидах.
Выявлен целый ряд этиологических факторов, ассоциированных с фрагментацией ДНК и ослаблением целостности хроматина в сперматозоидах. К ним относятся как экзогенные воздействия (курение, радиация, химиотерапия, загрязнение окружающей среды), так и различные патофизиологические состояния: лейкоцитоспермия, варикоцеле, рак семенников и другие. Интересно отметить, что яйцеклетка обладает определенным потенциалом репарации повреждений ДНК сперматозоида, однако при значительных нарушениях этот потенциал может оказаться недостаточным для обеспечения нормального развития эмбриона.
Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов как диагностический метод стал применяться примерно 30 лет назад. Основным стимулом к развитию данной методологии послужил поиск причин мужского бесплодия, не объясняемых стандартными параметрами спермограммы. Другим важным фактором стало все более широкое внедрение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), где для повышения вероятности успешной беременности требовались дополнительные предикторы мужской фертильности. В настоящее время наибольшее распространение получил метод структурной оценки хроматина сперматозоидов (SCSA — sperm chromatin structure assay), который характеризуется небольшой индивидуальной вариацией и относительным постоянством во времени индекса фрагментации сперматозоидов.
Простатит и варикоцеле представляют собой одни из наиболее распространенных приобретенных урологических заболеваний у мужчин репродуктивного возраста. Эти патологические состояния привлекают особое внимание специалистов в области репродуктивной медицины в связи с их потенциальным негативным влиянием на мужскую фертильность и качество спермы.
Простатит чаще всего развивается в хронической форме на протяжении нескольких лет. Основная причина заболевания заключается в формировании инфекционного очага в предстательной железе, хотя нередко встречается простатит неинфекционного характера. Эпидемиологические исследования показывают, что распространенность хронического простатита составляет 10-15% в общей популяции мужчин в возрасте от 20 до 50 лет. При этом среди молодых мужчин более распространен асимптоматический инфекционный простатит, что затрудняет своевременную диагностику и лечение. В клинической практике отмечается, что у трети больных простатит осложняется везикулитом, эпидидимитом и орхитом, что может усугублять негативное влияние на репродуктивную функцию.
Риск развития простатита увеличивается с возрастом, что связано с возрастными изменениями в тканях предстательной железы и снижением локального иммунитета. В современной медицинской литературе хронический простатит, наряду с ожирением, метаболическим синдромом, сахарным диабетом 2 типа, эректильной дисфункцией и андрогенным дефицитом, рассматривается как возраст-ассоциированное заболевание. Между всеми этими состояниями прослеживаются определенные патогенетические связи, что указывает на их комплексное влияние на мужское репродуктивное здоровье.
Варикоцеле характеризуется расширением вен лозовидного сплетения яичка вследствие органной венной почечной гипертензии и первичной недостаточности стенки семенниковой вены. В большинстве случаев варикоцеле локализуется на левой стороне, что объясняется анатомическими особенностями венозного оттока. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что распространенность клинического варикоцеле у мужчин составляет около 15%. Наиболее часто заболевание диагностируется в возрасте от 15 до 25 лет, тогда как в преклонном возрасте встречается относительно редко.
На развитие варикоцеле влияют многочисленные факторы, включая возраст, характер трудовой деятельности и даже этническую принадлежность. Интересно отметить, что часто варикоцеле развивается у мальчиков в период полового созревания одновременно с увеличением яичек, что может быть связано с гормональными и гемодинамическими изменениями в этот период. С точки зрения профессиональной принадлежности, варикоцеле чаще встречается среди лиц, занимающихся физическим трудом, что, вероятно, обусловлено повышенной нагрузкой на венозную систему малого таза.
Длительный застой венозной крови при варикоцеле ведет к гипоксии тканей яичка, развитию склеротических изменений и повреждению гематотестикулярного барьера. Эти патологические процессы сопровождаются усилением интенсивности перекисного окисления липидов, что в конечном итоге может приводить к оксидативному стрессу и повреждению ДНК сперматозоидов.
Многочисленные клинические исследования свидетельствуют о негативном влиянии простатита и варикоцеле на мужскую фертильность. Установлено, что варикоцеле может являться причиной как первичного, так и вторичного бесплодия и наблюдается у 35-50% пациентов с бесплодием. Это делает данное заболевание одной из наиболее распространенных корригируемых причин мужского бесплодия.
Что касается простатита, то взаимосвязь между этим заболеванием и бесплодием у мужчин остается предметом научных дискуссий. Однако сопутствующие простатиту патологические состояния, такие как лейкоцитоспермия, повышенный уровень реактивных форм кислорода в семенной жидкости и иммунологические отклонения, рассматриваются как существенные кофакторы в развитии бесплодия у пациентов с этим диагнозом.
И простатит, и варикоцеле могут сопровождаться ухудшением параметров спермограммы, хотя имеющиеся данные по этому вопросу часто противоречивы. Кроме того, вредные привычки, например курение, у пациентов с варикоцеле могут дополнительно ухудшать показатели спермограммы, повышать активность перекисного окисления липидов и сопровождаться изменениями протеома семенной жидкости.
Клинические исследования демонстрируют, что после варикоцелэктомии у пациентов улучшаются параметры спермограммы, а в случае бесплодия повышается успешность применения вспомогательных репродуктивных технологий. Таким образом, данные андрологические заболевания могут оказывать существенное влияние на мужскую фертильность, однако требуются дополнительные исследования для уточнения их патофизиологических и эпидемиологических аспектов.
Помимо ухудшения параметров спермограммы и других репродуктивных нарушений, негативные эффекты варикоцеле и простатита на мужскую фертильность могут включать нарушение целостности ДНК сперматозоидов. В дополнение к стандартным параметрам спермограммы оценка степени повреждения ДНК в сперматозоидах дает важную диагностическую и прогностическую информацию о репродуктивном потенциале мужчины. Тем не менее, необходимы исследования, устанавливающие референтные значения уровня повреждения ДНК сперматозоидов в норме и при различных патологических состояниях, чтобы обосновать необходимость использования различных методов оценки целостности ДНК сперматозоидов в рутинной лабораторной диагностике.
Материалы и методы исследования
Настоящее исследование было проведено на группе из 53 мужчин-добровольцев активного репродуктивного возраста. Рекрутирование участников осуществлялось посредством объявлений в сети Интернет, а также после публичных лекций по мужскому репродуктивному здоровью. Для включения в группу испытуемых были установлены следующие критерии: постоянное проживание в Новосибирске, клиническое здоровье на момент исследования, отсутствие медикаментозного лечения, воздержание от половых контактов и употребления алкоголя в течение 2-3 суток до начала обследования. Каждый участник был подробно ознакомлен с методами и целями исследования, после чего предоставил письменное информированное согласие.
Все испытуемые прошли комплексное обследование, включающее физикальный осмотр врачом-андрологом, анкетирование и антропометрические измерения (рост и масса тела). Физикальное обследование было направлено на оценку состояния наружных половых органов, измерение битестикулярного объема (БТО) с помощью орхидометра Прадера, а также пальпацию и ректальное исследование простаты с оценкой её размера, выраженности срединной бороздки, однородности, консистенции и болезненности.
Из исследования были исключены мужчины с азооспермией, крипторхизмом, гипоспадией, кистами придатков и семенников, что позволило сформировать относительно гомогенную выборку. Анкетирование охватывало демографические и этнические характеристики, социальный статус и профессиональную принадлежность участников. Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывался по стандартной формуле: масса тела (кг)/рост (м2).
Возрастной диапазон обследованных составил от 20 до 45 лет при среднем возрасте 30,5 ± 0,9 года. Преобладающее большинство участников принадлежало к славянской этнической группе.
На основании результатов беседы с андрологом, сбора жалоб и анамнеза, а также физикального осмотра у 31 мужчины были клинически диагностированы простатит или варикоцеле, в некоторых случаях сопровождавшиеся жалобами на бесплодие. Группа пациентов с простатитом включила 9 человек с хронической формой заболевания, а группа с варикоцеле – 22 мужчины с преимущественно левосторонним варикоцеле различных стадий.
Интересно отметить, что у двух мужчин были диагностированы одновременно простатит и варикоцеле. Один из них был включен в группу с варикоцеле из-за слабых клинических проявлений конгестивного простатита, а другой – в группу с простатитом из-за сочетанного проявления простатита и воспаления придатков. Такой дифференцированный подход к классификации обеспечил более четкое разграничение исследуемых патологий.
Контрольная группа состояла из 22 мужчин без урогенитальных заболеваний в анамнезе, не имеющих жалоб на репродуктивное здоровье и характеризующихся нормальными показателями спермограммы (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов) согласно критериям Всемирной организации здравоохранения.
Процедура сбора и анализа эякулята проводилась в строгом соответствии с рекомендациями ВОЗ. Образцы эякулята получали путем мастурбации в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры. Для обеспечения разжижения эякулята контейнеры с образцами выдерживали в термостате при температуре 37°C в течение 1 часа.
Концентрацию сперматозоидов определяли методом подсчета в камере Горяева визуально под световым микроскопом при увеличении 400× после окрашивания аликвоты эякулята трипановым синим при температуре 4°C. Для оценки доли подвижных сперматозоидов категорий А (с прогрессивным прямолинейным движением более 25 мкм/с) и Б (со скоростью 2-25 мкм/с) использовали спермоанализатор SFA-500-2 производства компании «Биола» (Россия).
Для анализа морфологии сперматозоидов мазки эякулята окрашивали наборами Diff-Quik («Абрис+», Россия). Морфологическую оценку первых 200 сперматозоидов проводили по строгим критериям Крюгера с использованием микроскопа Carl Zeiss (Германия) при увеличении 1000× под иммерсией.
В сыворотке крови участников исследования были определены уровни лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов, тестостерона, эстрадиола, ингибина В. Для этого применялся иммуноферментный метод с использованием соответствующих наборов реактивов: гонадотропин ИФА-ФСГ, гонадотропин ИФА-ЛГ, стероид ИФА-тестостерон-01 (производства «Алкор Био», Санкт-Петербург), эстрадиол-ИФА («Хема Медика», Москва), Inhibin B Gen II ELISA («Beckman Coulter», Inc, США).
Для анализа фрагментации ДНК часть эякулята центрифугировали, семенную жидкость удаляли, а к осадку сперматозоидов добавляли раствор RNA-later для консервации ДНК и РНК сперматозоидов («Applied Biosystems» Inc., США). Полученную суспензию сперматозоидов помещали в холодильник на ночь, после чего замораживали и хранили при температуре -40°C до проведения анализа на фрагментацию ДНК.
Для оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах был применен метод SCSA (sperm chromatin structure assay), предложенный Эвенсоном с соавторами в 1991 году, с некоторыми модификациями. Принцип метода основан на способности красителя акридинового оранжевого флуоресцировать зеленым цветом при связывании с двухцепочечной (нативной) ДНК и красным при связывании с одноцепочечной (денатурированной) ДНК. Это позволяет дифференцировать сперматозоиды с интактной и фрагментированной ДНК.
Процедура анализа включала следующие этапы: после размораживания каждый образец разводили в TNE-буфере (0,01 М Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, pH 7,4) до концентрации сперматозоидов 1 млн в 1 мл. К 100 мкл разведенных в буфере сперматозоидов добавляли 200 мкл кислотного буфера (0,1%-ный Тритон-X-100, 0,15 М NaCl, 0,08 н. HCl, pH 1,2). После инкубации в течение 30 секунд к суспензии сперматозоидов добавляли 600 мкл красящего раствора, содержащего 6 мг/л акридинового оранжевого в соответствующем буфере (0,2 М Na2HPO4, 1 мМ ЭДТА (динатриевая соль), 0,15 M NaCl, 0,1 M лимонной кислоты, pH 6).
Подсчет количества сперматозоидов с красной и зеленой флуоресценцией проводили на флуоресцентном цитометре Guava Easy Cyte Mini («Guava», США). Для обеспечения статистической достоверности каждый образец оценивали трижды, анализируя по 5000 клеток в каждом измерении. Индекс фрагментации ДНК (ИФД) рассчитывали по формуле: количество клеток с красной флуоресценцией × 100% / суммарное количество клеток с красной и зеленой флуоресценцией. Таким образом, ИФД отражает долю дефектных сперматозоидов, имеющих разрывы цепи ДНК.
Важно отметить, что клетки эякулята, имеющие значительные отличия от нормальных зрелых сперматозоидов по размерам и рыхлости ядра, исключались из анализа, поскольку не попадали в настраиваемое поле зрения прибора. Это обеспечивало более точную оценку именно зрелых сперматозоидов.
Три группы мужчин (с варикоцеле, простатитом и контрольная группа) сравнивали по индексу фрагментации ДНК, антропометрическим, гормональным и сперматогенным показателям с использованием однофакторного дисперсионного анализа (пакет компьютерных программ STATISTICA, версия 6.0). Для всех исследуемых показателей рассчитывали среднюю арифметическую и ошибку средней (Mean±SE), медиану (Median), 25-й и 75-й квартили.
Для выявления взаимосвязи между индексом фрагментации ДНК и показателями спермограммы рассчитывали коэффициенты корреляции по Пирсону. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.
Результаты исследования
Проведенный анализ антропометрических и анамнестических данных показал, что рост, масса тела и индекс массы тела, возраст начала половой жизни и сексуальная активность мужчин трех групп не имели статистически значимых различий. Однако возраст мужчин с простатитом был достоверно выше, чем в контрольной группе, что соответствует общей тенденции возрастного проявления этого заболевания. Интересным наблюдением стало то, что битестикулярный объем (БТО) был статистически значимо ниже у мужчин с простатитом по сравнению с контролем.
Анализ социально-демографического профиля участников исследования показал, что доля женатых мужчин в группах составила от 73 до 89%. При этом важно отметить, что имели детей лишь от 18 до 33% испытуемых, хотя различия между группами не достигали уровня статистической значимости (p>0,05). Это наблюдение косвенно свидетельствует о том, что, несмотря на относительно высокий процент состоящих в браке мужчин, реализация репродуктивной функции у них значительно ниже, что может отражать тенденцию к отложенному родительству или указывать на возможные репродуктивные проблемы.
В ходе исследования было выявлено достоверное снижение некоторых параметров спермограммы при андрологических заболеваниях. Так, концентрация сперматозоидов была статистически значимо ниже в группе лиц с простатитом по сравнению с контролем (p<0,01). Аналогичная тенденция прослеживалась и в группе с варикоцеле, хотя она не достигала уровня статистической значимости.
Особенно выраженные изменения были обнаружены в отношении подвижности сперматозоидов. Доля подвижных сперматозоидов у больных варикоцеле снижалась в 1,6 раза, а у больных простатитом – в 2,8 раза по отношению к контрольной группе (p<0,001). Эти данные указывают на существенное негативное влияние исследуемых андрологических заболеваний на функциональное состояние сперматозоидов, что может быть одним из механизмов снижения фертильности при данных патологиях.
Интересно, что при анализе концентрации основных репродуктивных гормонов в сыворотке крови не было обнаружено достоверных различий между группами. Кроме того, не было установлено статистически значимых коэффициентов корреляции между гормональными и сперматогенными показателями. Данное наблюдение позволяет сделать вывод о том, что варикоцеле и простатит не сопровождаются значимыми изменениями в функционировании гипофизарно-семенниковой эндокринной оси. Поскольку все гормональные показатели находились в пределах референтных значений, можно утверждать, что снижение качества спермы при варикоцеле или простатите не опосредуется изменениями гормонального статуса.
Одним из наиболее важных результатов проведенного исследования стало обнаружение того факта, что пациенты с варикоцеле и простатитом достоверно отличались от контрольной группы более высокими показателями индекса фрагментации ДНК (ИФД). Значения ИФД были в 1,8-1,9 раза выше у мужчин с исследуемыми андрологическими заболеваниями по сравнению со здоровыми мужчинами (p<0,005). Эти данные свидетельствуют о существенном влиянии варикоцеле и простатита на целостность генетического материала сперматозоидов, что может иметь значительные последствия для репродуктивного потенциала мужчин с данными заболеваниями.
Проведенный корреляционный анализ выявил наличие статистически достоверной связи между ИФД сперматозоидов и концентрацией сперматозоидов, а также долей подвижных сперматозоидов. При этом с другими показателями спермограммы достоверных линейных связей установлено не было. Эти результаты указывают на то, что фрагментация ДНК сперматозоидов может быть ассоциирована с определенными аспектами качества спермы, что имеет важное значение для понимания механизмов, лежащих в основе снижения фертильности при варикоцеле и простатите.
Обсуждение результатов
В настоящем исследовании у мужчин репродуктивного возраста, страдающих варикоцеле и простатитом, было установлено снижение ряда параметров спермограммы по сравнению со здоровыми мужчинами контрольной группы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные андрологические заболевания негативно влияют на качество спермы, что в конечном итоге может приводить к уменьшению фертильной способности сперматозоидов и повышению риска субфертильности в этих группах пациентов.
Данные подтверждают полученные ранее факты, свидетельствующие об ухудшении параметров спермограммы у мужчин с варикоцеле или простатитом. Исследования других авторов также демонстрировали негативное влияние этих заболеваний на концентрацию, подвижность и морфологию сперматозоидов. Более того, в настоящей работе показано, что мужчины с варикоцеле и простатитом характеризуются более высоким индексом фрагментации ДНК сперматозоидов по сравнению со здоровыми мужчинами.
Повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов при варикоцеле и простатите может служить одним из патогенетических механизмов сниженной фертильности или бесплодия, обусловленного этими заболеваниями. Полученные данные дополняют имеющиеся в литературе сведения о нарушениях целостности ДНК сперматозоидов у больных варикоцеле. Так, различные исследования показали, что варикоцеле ассоциировано с повышенным уровнем оксидативного стресса в семенниках, что приводит к повреждению ДНК сперматозоидов и снижению их функциональной активности.
В современной научной литературе нет однозначного мнения относительно взаимосвязи между индексом фрагментации ДНК сперматозоидов и стандартными показателями спермограммы (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов). В исследовании была установлена статистически достоверная линейная отрицательная взаимосвязь между ИФД сперматозоидов и концентрацией или долей подвижных сперматозоидов. Кроме того, в группах с варикоцеле и простатитом подвижность сперматозоидов была ниже, а ИФД – выше по сравнению с контролем, хотя не все испытуемые этих групп характеризовались патоспермией.
Полученные результаты согласуются с данными других исследователей. Например, при изучении повреждений ДНК методом SCSA у мужчин из бесплодных пар было отмечено, что в группе мужчин с нормальными параметрами спермограммы только 15% имели ИФД больше 20%, в то время как в группе с патоспермией таких мужчин было уже 35%. В другом исследовании у пациентов, обратившихся в клинику по поводу бесплодия, были установлены отрицательные достоверные коэффициенты корреляции между концентрацией (r=-0,207) и долей подвижных сперматозоидов (r=-0,624) и ИФД, оцененным по методу SCSA.
Таким образом, между параметрами спермограммы и уровнем фрагментации ДНК, по-видимому, существует определенная взаимосвязь, которая не всегда имеет линейный характер. Это может быть обусловлено многофакторной природой формирования нарушений целостности ДНК сперматозоидов, которая включает различные механизмы, такие как апоптоз, оксидативный стресс и нарушения процесса ремоделирования хроматина.
На основании полученных результатов можно предположить, что ухудшение качества спермы у мужчин с варикоцеле и простатитом, а в конечном итоге – повышение риска субфертильности, могут быть частично обусловлены фрагментацией ДНК сперматозоидов. Это подчеркивает важность комплексного подхода к оценке репродуктивного потенциала мужчины, включающего не только традиционные параметры спермограммы, но и оценку целостности ДНК сперматозоидов.
Основываясь на результатах настоящей работы и работ других авторов, можно говорить о самостоятельной прогностической и диагностической ценности анализа фрагментации ДНК сперматозоидов. Этот анализ может с успехом дополнять стандартную спермограмму, обеспечивая более полное представление о репродуктивном потенциале мужчины, однако не заменяя её полностью.
Следует отметить, что до настоящего времени не существует общепринятых клинически обоснованных пороговых значений ИФД сперматозоидов, что в определенной степени ограничивает применение метода SCSA в рутинной клинической диагностике. Неопределенность в референтных значениях ИФД сперматозоидов в значительной степени обусловлена применением различных вариаций метода, отсутствием стандартизированных протоколов пробоподготовки, использованием различных репродуктивных параметров в качестве оценки потенциала мужской фертильности, а также недостаточной изученностью факторов, влияющих на целостность ДНК в сперматозоидах.
В циклах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) обычно оценивается влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на долю успешных зачатий, жизнеспособность эмбрионов или плодов. Так, при оценке результатов оплодотворения in vitro (IVF) и интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) было установлено, что наступление беременности наблюдалось при пороговых значениях ИФД 15,4±4,6%, но при ИФД 31,1±3,2% беременность уже не наступала. Интересно, что в обеих группах мужчин стандартные параметры спермограммы достоверно не различались, что еще раз подчеркивает важность оценки фрагментации ДНК сперматозоидов.
В других работах показано, что в общей популяции мужчин шансы спонтанной беременности были высокими и постоянными при ИФД в интервале 0-20%, но уменьшались, когда ИФД превышал 20%. При ИФД, равном 30-40%, шансы наступления спонтанной беременности уменьшались практически до нуля. Эти данные свидетельствуют о значительном влиянии фрагментации ДНК сперматозоидов на фертильность мужчин и успешность зачатия.
При использовании метода SCSA для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов некоторые авторы рекомендуют придерживаться в качестве референтных значений нормы ИФД до 15%. Значения ИФД в интервале от 15 до 27% предлагается рассматривать как пограничные, а к высоким значениям относить ИФД более 27%. В исследовании среднее значение ИФД в группе контроля составило 15,02±0,94%, что соответствует верхней границе нормы, предложенной другими авторами. Однако определенно судить о связи значений ИФД с демографической фертильностью обследованных мужчин не представлялось возможным, поскольку большинство из них не имели детей.
Важно отметить, что на целостность ДНК сперматозоидов могут оказывать влияние различные факторы, включая условия хранения, транспортировки и подготовки образцов сперматозоидов. В литературе имеются сведения о том, что значения ИФД могут варьироваться в зависимости от методики обработки эякулята. Например, установлено, что у фертильных доноров значения ИФД, полученные методом SCD (дисперсия хроматина в сперматозоидах, оцениваемая с помощью флуоресцентной микроскопии), варьировались от 8 до 28% сразу после размораживания осадков сперматозоидов. При последующей инкубации при 37°C наблюдалось увеличение значений ИФД в среднем на 8,3% за 1 час в течение первых 4 часов.
В других экспериментах оценивалась степень целостности ДНК сперматозоидов в свежих образцах эякулята, которые подвергались центрифугированию в градиенте плотности или обогащению методом всплытия с последующей инкубацией при комнатной температуре либо при 37°C. Целостность ДНК в сперматозоидах оценивали методом SCSA. Было показано, что ИФД сперматозоидов в свежем эякуляте составлял 15,8±9,6%, центрифугирование в градиенте плотности увеличивало ИФД до 29,7±20,4%, а методом всплытия удавалось значительно понизить ИФД до 8,9±6,7%. Инкубация сперматозоидов при 37°C в течение 3 часов приводила к повышению фрагментации ДНК, но значительное повышение наблюдалось только после 24 часов инкубации. В то же время, при комнатной температуре ИФД оставался стабильным в течение, по крайней мере, 5 часов.
Эти данные свидетельствуют о необходимости дополнительной экспериментальной проработки и стандартизации протокола хранения и подготовки эякулята к определению ИФД методом SCSA. Кроме того, можно предположить, что используемая в работе обработка эякулята, проводимая в соответствии с рекомендациями ВОЗ, могла несколько завышать значения ИФД за счет неспецифической фрагментации ДНК, обусловленной инкубацией эякулята в течение 1 часа при 37°C, необходимой для его разжижения, а также процедурой заморозки-оттаивания.
Тем не менее, полученные результаты демонстрируют достоверное повышение ИФД сперматозоидов у мужчин с варикоцеле и простатитом по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о негативном влиянии этих заболеваний на целостность ДНК сперматозоидов. Это может быть обусловлено различными патогенетическими механизмами, включая оксидативный стресс, воспалительные процессы и нарушения микроциркуляции в тестикулярной ткани.
В практическом аспекте, полученные результаты подчеркивают важность комплексного подхода к оценке репродуктивного здоровья мужчин, включающего не только стандартное обследование, но и оценку фрагментации ДНК сперматозоидов. Это особенно актуально для пациентов с андрологическими заболеваниями, такими как варикоцеле и простатит, которые могут не иметь выраженных нарушений стандартных параметров спермограммы, но характеризоваться повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов.
Кроме того, оценка фрагментации ДНК сперматозоидов может иметь прогностическое значение для определения вероятности успешного зачатия, как при естественном оплодотворении, так и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий. Это может быть особенно полезным для пар с необъяснимым бесплодием или с повторными неудачами ВРТ.
Необходимо отметить, что для более широкого внедрения метода оценки фрагментации ДНК сперматозоидов в клиническую практику требуется дальнейшая стандартизация протоколов пробоподготовки и анализа, а также установление четких референтных значений ИФД для различных клинических ситуаций. Это позволит повысить точность диагностики и прогнозирования фертильности у мужчин с различными андрологическими заболеваниями.
В целом, результаты настоящего исследования демонстрируют, что варикоцеле и простатит ассоциированы с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, что может быть одним из механизмов снижения фертильности при этих заболеваниях. Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов с помощью метода SCSA представляется перспективным дополнительным диагностическим инструментом в андрологической практике, который может использоваться для более точной оценки репродуктивного потенциала мужчин и оптимизации тактики ведения пациентов с нарушениями репродуктивной функции.
От автора
Проведенное исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с варикоцеле и простатитом позволило получить важные результаты, расширяющие представления о патогенезе репродуктивных нарушений при этих андрологических заболеваниях. Структурный анализ хроматина сперматозоидов методом SCSA предоставил ценную информацию о состоянии генетического материала эякуляторных сперматозоидов у обследованных групп мужчин.
У пациентов репродуктивного возраста, страдающих простатитом, было выявлено статистически значимое снижение концентрации и доли подвижных сперматозоидов в эякуляте. У мужчин с варикоцеле наблюдалось преимущественное снижение подвижности сперматозоидов при относительно сохранной их концентрации. При этом в обеих группах индекс фрагментации ДНК сперматозоидов был достоверно выше по сравнению с контрольной группой здоровых мужчин. Эти результаты указывают на значимую роль повреждения ДНК сперматозоидов в патогенезе снижения фертильности при варикоцеле и простатите.
Полученные данные дополняют и расширяют имеющиеся представления о механизмах развития репродуктивных нарушений при андрологических заболеваниях. Помимо влияния на стандартные параметры спермограммы, варикоцеле и простатит могут приводить к повреждению генетического материала сперматозоидов, что в свою очередь может негативно отражаться на их способности к оплодотворению и нормальному развитию эмбриона.
Установленная в исследовании взаимосвязь между индексом фрагментации ДНК и некоторыми параметрами спермограммы свидетельствует о существовании определенных патогенетических связей между структурной целостностью ДНК и функциональным состоянием сперматозоидов. Однако отсутствие линейных корреляций с морфологией сперматозоидов указывает на относительную независимость этих характеристик и подчеркивает самостоятельное диагностическое значение оценки фрагментации ДНК.
Важно отметить, что для более широкого внедрения метода SCSA в клиническую практику необходимы дополнительные исследования, направленные на стандартизацию протоколов и определение референтных значений ИФД в норме и при различных патологических состояниях. Это позволит повысить точность диагностики и прогнозирования фертильности у мужчин с андрологическими заболеваниями.
Следует подчеркнуть, что, несмотря на определенные методические ограничения, оценка фрагментации ДНК сперматозоидов представляет собой перспективный диагностический инструмент, который может дополнять стандартное андрологическое обследование и способствовать более точной оценке репродуктивного потенциала мужчин. Это особенно актуально для пациентов с варикоцеле и простатитом, у которых повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов может быть одним из ключевых факторов развития субфертильности или бесплодия.
Результаты проведенного исследования открывают новые горизонты для разработки персонализированных подходов к диагностике и лечению репродуктивных нарушений у мужчин с андрологическими заболеваниями. Включение оценки фрагментации ДНК сперматозоидов в стандартный алгоритм обследования пациентов с варикоцеле и простатитом может способствовать более эффективному выявлению пациентов с высоким риском репродуктивных нарушений и оптимизации тактики их ведения.
Перспективным направлением дальнейших исследований является изучение динамики индекса фрагментации ДНК сперматозоидов после лечения варикоцеле и простатита, а также оценка взаимосвязи между уровнем фрагментации ДНК и результатами применения вспомогательных репродуктивных технологий у данной категории пациентов. Кроме того, представляет интерес изучение молекулярных механизмов повреждения ДНК сперматозоидов при андрологических заболеваниях, что может способствовать разработке новых подходов к патогенетической терапии и профилактике репродуктивных нарушений.
Таким образом, исследование фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин с варикоцеле и простатитом предоставляет важную информацию о состоянии генетического материала гамет при этих заболеваниях и расширяет представления о патогенезе репродуктивных нарушений. Дальнейшее изучение данной проблемы и внедрение метода оценки фрагментации ДНК сперматозоидов в клиническую практику может способствовать совершенствованию диагностики и лечения мужского бесплодия.
